ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF BIOACTIVE NEEM OIL CONSTITUENTS WITH ANTICANCER ACTIVITY IN BREAST CANCER CELL LINES AND DEVELOPMENTAL TOXICITY IN ZEBRAFISH EMBRYOS. Masters thesis, King Fahd University of Petroleum and Minerals.

PDF (MS Thesis) Thesis.Yara2.with Dean sign.pdf - Submitted Version Restricted to Repository staff only until 23 December 2026. Download (3MB)

Arabic Abstract

يُعَدُّ زيت بذور النيم (Azadirachta indica) مزيجًا معقدًا من الأحماض الدهنية ومكوّنات ثلاثية التربين ذات خصائص مضادة للسرطان موثَّقة في الأدبيات، إلا أن استخدامه بصورته الخام يبقى محدودًا بسبب تباين تركيبه ومخاوف السُّمِّيّة. هدفت هذه الدراسة إلى عزل وتوصيف المكوّنات الحيوية النشطة في زيت بذور النيم المعصور على البارد باستخدام مسار كروماتوغرافي بسيط، بالإضافة إلى تقييم نشاطها المضاد للسرطان على خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية، إلى جانب دراسة السُّمِّيّة النمائية في أجنة أسماك الزرد (zebrafish). أظهر التحليل الأوّلي بزمن الاستبقاء والكروماتوغرافيا الغازية المقترنة بمطياف الكتلة (GC–MS) أنّ الزيت الخام يتكوّن أساسًا من أحماض دهنية من نوع C16–C18 وإستراتٍ مرتبطة بها، مع وجود مكوّنات ذات كتل جزيئية أعلى بنِسَبٍ أقل. ولغرض إثراء هذه المكوّنات، جرى إذابة 10 غرام من زيت النيم المعصور على البارد في مزيجٍ من المذيبات العضوية ثم حقنه مباشرة في جهاز الكروماتوغرافيا السائلة شبه التحضيرية ذات الطور العكسي (semi-preparative RP-HPLC)، مما أتاح الحصول على تسعة أجزاء (A1–A9) ومن الملفت أنّ الجزء A9 حُصِل عليه على هيئة قمّة كروماتوغرافية واحدة حادّة ومفصولة جيدًا، تمثّل مركبًا نقيًا تقريبًا معزولًا مباشرة من الزيت الخام من خلال خطوة واحدة بسيطة من HPLC دون الحاجة إلى مراحل كروماتوغرافية متعدِّدة. أظهرت تحاليل LC–MS وHRMS/MS أن الجزء A5 مُثرى بمركّب من نوع nimbin، وأن الجزء A7 يحتوي على مكوّنات من نوع salannin وepoxyazadiradione، في حين يحتوي الجزء A9 على مركّب وحيد من نوع azadirone. تم تقييم النشاط المضاد للسرطان على خطَّي خلايا سرطان الثدي البشري: خلايا MCF-7 (موجبة لمستقبلات الإستروجين) وخلايا MDA-MB-231 ثلاثية السلبية. أظهر الزيت الخام سُمِّيّة خلوية متواضعة (قيم IC₅₀ تقارب 1092.6 ميكروغرام/مل في خلايا MCF-7 و609.7 ميكروغرام/مل في خلايا MDA-MB-231)، في حين أدّى فصل الزيت إلى زيادة ملحوظة في الفعالية في بعض الأجزاء. كان الجزء A9 (المكوَّن من مركب واحد) هو الأكثر فاعلية، حيث بلغت قيم IC₅₀ 123.6ميكروغرام/مل في خلايا MCF-7 و‎79.96‎ ميكروغرام/مل في خلايا MDA-MB-231، بينما أظهر الجزءان A5 وA7 نشاطًا متوسطًا يعتمد على نوع الخلايا. أظهرت اختبارات أجنة أسماك الزرد أن الزيت الخام يسبّب سُمِّيّة نمائية عند تراكيز ≥ 5–10 ميكروغرام/مل، كما أظهرت الأجزاء الأكثر “تعقيدًا” مثل A5 وA7 سُمِّيّة نمائية وعصبية عند التراكيز الأعلى من 20 ميكروغرام/مل، في حين أظهر الجزء A9 أقل درجة من السُّمِّيّة النمائية عند تراكيز كانت في الوقت نفسه سامة بقوة لخلايا السرطان. بشكلٍ عام، تُبيّن هذه الدراسة أن استخدام خطوة واحدة بسيطة من HPLC شبه التحضيري يمكّن من عزل مركّب نقي تقريبًا من نوع azadirone مباشرة من زيت النيم المعصور على البارد، وأن هذا المكوّن يُظهر مزيجًا واعدًا من النشاط المضاد لسرطان الثدي مع ملفّ سُمِّيّة نمائية أكثر ملاءمة مقارنة بالزيت الخام والأجزاء الأكثر تعقيدًا. وبناءً على ذلك، يُعَدّ الجزء A9(ومركّب azadirone المنقّى منه) مرشّحًا قويًا لمزيد من أعمال التوكيد البنيوي والدراسات الآلية، والتقييم قبل السريري ضد الأنماط العدوانية من سرطان الثدي، ولا سيّما النوع الثلاثي السلبي.

English Abstract

Neem (Azadirachta indica) seed oil is a complex mixture of fatty acids and triterpenoid constituents with reported anticancer properties. Still, its crude use is limited by variable composition and safety concerns. This study aimed to isolate and characterize bioactive constituents from cold-pressed neem seed oil using a simple chromatographic workflow and to evaluate their anticancer activity in human breast cancer cell lines and their developmental toxicity in zebrafish embryos. Initial Gas Chromatography–Mass Spectrometry (GC-MS) profiling of the crude oil showed a lipid matrix dominated by C16–C18 fatty acids and related esters, with minor higher-mass components. To enrich the latter, 10 g of cold-pressed neem oil was dissolved in a mixed organic solvent and subjected directly to semi-preparative reversed-phase High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), yielding nine primary fractions (A1–A9). Remarkably, under these conditions, fraction A9 was obtained as a single, well-resolved chromatographic peak, representing an essentially pure compound isolated from the crude oil in a single, straightforward HPLC step, without the need for multiple successive chromatographic procedures. Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (LC–MS) and High-resolution tandem mass spectrometry (HR-MS/MS) analyses indicated that A5 contained a nimbin-type constituent, A7 contained salannin-/epoxyazadiradione-type constituents, and A9 contained a single azadirone-type limonoid. Anticancer activity was assessed in human breast adenocarcinoma cell line MCF-7 (estrogen receptor–positive, ER⁺) and MDA-MB-231 (triple-negative) breast cancer cell lines. The crude oil showed modest cytotoxicity (IC₅₀ ≈ 1092.6 µg/mL in MCF-7 and 609.7 µg/mL in MDA-MB-231), whereas fractionation markedly enhanced activity in selected fractions. The single-compound fraction A9 was the most potent, with Half-maximal Inhibitory concentration (IC₅₀) values of 123.6 µg/mL (MCF-7) and 79.96 µg/mL (MDA-MB-231), while A5 and A7 showed moderate, line-dependent effects. Zebrafish embryo assays revealed developmental toxicity of the crude oil at ≥5–10 µg/mL and higher toxicity for the more “crude” active fractions (A5, A7), whereas A9 displayed the lowest developmental toxicity at concentrations that were strongly cytotoxic to cancer cells. Overall, this work demonstrates that a single, simple semi-preparative HPLC step can isolate an essentially pure azadirone-type constituent directly from cold-pressed neem oil, and that this constituent combines promising anticancer activity with a more favorable developmental toxicity profile than the crude oil and more complex fractions. This fraction (A9) is therefore a strong candidate for full structural confirmation like Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and single-crystal X-ray diffraction (SC-XRD) and further mechanistic and in vivo evaluation.

Item Type:	Thesis (Masters)
Subjects:	Chemistry
Department:	College of Chemicals and Materials > Chemistry
Committee Advisor:	Chanbasha, Basheer
Committee Members:	Al-Thagfi, Jameel and Al-Thukair, Assad
Depositing User:	YARA ALNADEEM (g202302410)
Date Deposited:	25 Dec 2025 08:28
Last Modified:	25 Dec 2025 08:28
URI:	http://eprints.kfupm.edu.sa/id/eprint/143860